Helmi i gjarprit përmban enzima që hidrolizojnë lidhjet esterike karboksil.Substratet për hidrolizë janë fosfolipidet, acetilkolina dhe acetati aromatik.Këto enzima përfshijnë tre lloje: fosfolipaza, acetilkolinesteraza dhe esteraza aromatike.Arginine esteraza në helmin e gjarprit gjithashtu mund të hidrolizojë argininën ose lizinën sintetike, por kryesisht hidrolizon lidhjet peptide proteinike në natyrë, kështu që i përket proteazës.Enzimat e diskutuara këtu veprojnë vetëm në substrate estere dhe nuk mund të veprojnë në asnjë lidhje peptide.Ndër këto enzima, funksionet biologjike të acetilkolinesterazës dhe fosfolipazës janë më të rëndësishme dhe janë studiuar plotësisht.Disa helme gjarpërinjsh kanë aktivitet të fortë esterazë aromatike, e cila mund të hidrolizojë p-nitrofenil etil ester, acetat a - ose P-naftalen dhe etil ester indol.Ende nuk dihet nëse ky aktivitet prodhohet nga një enzimë e pavarur apo një efekt anësor i njohur i karboksilesterazës, e lëre më rëndësinë e saj biologjike.Kur helmi i Agkistrodon halys Japonicus u reagua me p-nitrofenil etilik ester dhe indol etilik ester, hidrolizat e p-nitrofenolit dhe indol fenolit nuk u gjetën;Përkundrazi, nëse këta esterë reagojnë me helmin e gjarprit të nënspecieve të kobrës Zhoushan dhe helmin e gjarpërinjve Bungarus multicinctus, ato do të hidrolizohen shpejt.Dihet se këto helme kobra kanë aktivitet të fortë kolinesterazë, e cila mund të jetë përgjegjëse për hidrolizën e substrateve të mësipërme.Në fakt, Mclean et al.(1971).Këto helme gjarpërinjsh vijnë nga: kobra, kobra me qafë të zezë, kobra me buzë të zezë, kobra e artë, kobra egjiptiane, kobra mbretërore, kobra e artë, mamba e zezë dhe mamba me buzë të bardha (D. aw ende njeh gjarpërin me zile rombola lindore
Helmi i gjarprit mund të hidrolizojë etilik esterin metilindol, i cili është substrati për përcaktimin e aktivitetit të kolinesterazës në serum, por ky helm gjarpëri nuk tregon aktivitet kolinesterazë.Kjo tregon se ka një esterazë të panjohur në helmin e kobrës, e cila është e ndryshme nga kolinesteraza.Për të kuptuar natyrën e kësaj enzime, nevojitet punë e mëtejshme e ndarjes.
1, Fosfolipaza A2
(I) Vështrim i përgjithshëm
Fosfolipaza është një enzimë që mund të hidrolizojë gliceril fosfatin.Ekzistojnë 5 lloje të fosfolipazës në natyrë, përkatësisht fosfolipaza A2 dhe fosfolipaza.
A. , fosfolipaza B, fosfolipaza C dhe fosfolipaza D. Helmi i gjarprit përmban kryesisht fosfolipazë A2 (PLA2), disa helme gjarpërinjsh përmbajnë fosfolipazë B dhe fosfolipazat e tjera gjenden kryesisht në indet e kafshëve dhe bakteret.Fig. 3-11-4 tregon vendin e veprimit të këtyre fosfolipazave në hidrolizën e substratit.
Ndër fosfolipazat, PLA2 është studiuar më shumë.Mund të jetë enzima më e studiuar në helmin e gjarprit.Substrati i tij është lidhja esterike në pozicionin e dytë të Sn-3-glicerofosfatit.Kjo enzimë gjendet gjerësisht në helmin e gjarprit, helmin e bletës, helmin e akrepit dhe indet e kafshëve, dhe PLA2 është e bollshme në helmet e gjarpërinjve të katër familjeve.Për shkak se kjo enzimë thyen qelizat e kuqe të gjakut dhe shkakton hemolizë, quhet edhe "hemolizin".Disa njerëz e quajnë gjithashtu lecithinase hemolitike PLA2.
Ludeeke së pari zbuloi se helmi i gjarprit mund të prodhojë një përbërje hemolitike duke vepruar në lecithin përmes enzimave.Më vonë, Delezenne et al.vërtetoi se kur helmi i kobrës vepron në serumin ose të verdhën e kalit, ai formon një substancë hemolitike.Tashmë dihet se PLA2 mund të veprojë drejtpërdrejt në fosfolipidet e membranës së eritrociteve, duke shkatërruar strukturën e membranës së eritrociteve dhe duke shkaktuar hemolizë të drejtpërdrejtë;Mund të veprojë gjithashtu në serum ose lecitinë të shtuar për të prodhuar lecitinë hemolitike, e cila vepron në qelizat e kuqe të gjakut për të prodhuar hemolizë indirekte.Megjithëse PLA2 është i bollshëm në katër familjet e helmeve të gjarpërinjve, përmbajtja e enzimave në helmet e gjarpërinjve të ndryshëm është paksa e ndryshme.Gjarpër me zile (C
Helmi i gjarprit tregoi vetëm aktivitet të dobët PLA2.Tabela 3-11-11 ilustron krahasimin e aktivitetit të PLA2 të 10 helmeve kryesore të gjarpërinjve helmues në Kinë.
Tabela 3-11-11 Krahasimi i aktiviteteve të fosfolipazës VIII të 10 helmeve të gjarpërinjve në Kinë
Helmi i gjarprit
Lirimi i yndyrës
Acidi alifatik,
Cjumol/mg)
Aktiviteti hemolitik CHU50/^ g * ml)
Helmi i gjarprit
Lëshojnë acide yndyrore
(^raol/mg)
Aktiviteti hemolitik “(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
njëmbëdhjetë
Micracephal ophis
pesë pikë një zero
kalispallas
8. 68
dy mijë e tetëqind
gracilis
V, acutus
7. 56
* * #
Ofiofag hannah
tre pikë tetë dy
njëqind e dyzet
Bnugarus fasctatus
7,56
dyqind e tetëdhjetë
B. multicinctus
një pikë nëntë gjashtë
dyqind e tetëdhjetë
Viper një russelli
shtatë pikë zero tre
T, mucrosquamatus
një pikë tetë pesë
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
(2) Ndarja dhe pastrimi
Përmbajtja e PLA2 në helmin e gjarprit është e madhe dhe është e qëndrueshme ndaj nxehtësisë, acidit, alkalit dhe denaturantit, kështu që është e lehtë për t'u pastruar dhe ndarë PLA2.Metoda e zakonshme është që fillimisht të kryhet filtrimi me xhel në helmin e papërpunuar, më pas të kryhet kromatografia e shkëmbimit të joneve dhe hapi tjetër mund të përsëritet.Duhet të theksohet se tharja në ngrirje e PLA2 pas kromatografisë me shkëmbim jonik nuk duhet të shkaktojë grumbullim, sepse procesi i tharjes me ngrirje shpesh rrit forcën jonike në sistem, gjë që është një faktor i rëndësishëm që shkakton grumbullimin e PLA2.Përveç metodave të përgjithshme të mësipërme, janë miratuar edhe metodat e mëposhtme: ① Wells et al.② Analogu i substratit të PLA2 u përdor si ligand për kromatografinë e afinitetit.Ky ligand mund të lidhet me PLA2 në helmin e gjarprit me Ca2+.EDTA përdoret kryesisht si eluent.Pasi të hiqet Ca2+, afiniteti midis PLA2 dhe ligandit zvogëlohet dhe mund të shkëputet nga ligandi.Të tjerët përdorin tretësirë organike 30% ose 6mol/L ure si eluent.③ Kromatografia hidrofobike u krye me PheiiylSephar0SeCL-4B për të hequr gjurmët PLA2 në kardiotoksina.④ Antitrupi anti PLA2 u përdor si ligand për të kryer kromatografinë e afinitetit në PLA2.
Deri më tani, një numër i madh i helmit të gjarpërinjve PLAZ janë pastruar.Tu et al.(1977) renditi PLA2 të pastruar nga helmi i gjarprit përpara vitit 1975. Vitet e fundit, një numër i madh artikujsh rreth ndarjes dhe pastrimit të PLA2 janë raportuar çdo vit.Këtu, ne fokusohemi në ndarjen dhe pastrimin e PLA nga studiuesit kinezë.
Chen Yuancong et al.(1981) ndau tre lloje PLA2 nga helmi i Agkistrodon halys Pallas në Zhejiang, të cilat mund të ndahen në PLA2 acide, neutrale dhe alkaline sipas pikave të tyre izoelektrike.Sipas toksicitetit të tij, PLA2 neutrale është më toksike, e cila është identifikuar si neurotoksina presinaptike Agkistrodotoxin.PLA2 alkaline është më pak toksik, dhe PLA2 acidik nuk ka pothuajse asnjë toksicitet.Wu Xiangfu etj.(1984) krahasoi karakteristikat e tre PLA2, duke përfshirë peshën molekulare, përbërjen e aminoacideve, terminalin N, pikën izoelektrike, stabilitetin termik, aktivitetin e enzimës, toksicitetin dhe aktivitetin hemolitik.Rezultatet treguan se ato kishin peshë molekulare të ngjashme dhe stabilitet termik, por kishin dallime të konsiderueshme në aspekte të tjera.Në aspektin e aktivitetit të enzimës, aktiviteti i enzimës acide ishte më i lartë se aktiviteti i enzimës alkaline;Efekti hemolitik i enzimës alkaline në qelizat e kuqe të gjakut të miut ishte më i forti, i ndjekur nga enzima neutrale dhe enzima e acidit pothuajse nuk hemolizohej.Prandaj, supozohet se efekti hemolitik i PLAZ është i lidhur me ngarkesën e molekulës PLA2.Zhang Jingkang etj.(1981) kanë bërë kristale Agkistrodotoxin.Tu Guangliang etj.(1983) raportoi se një PLA toksike me një pikë izoelektrike prej 7.6 u izolua dhe u pastrua nga helmi i Vipera rotundus nga Fujian dhe vetitë e tij fizike dhe kimike, përbërja e aminoacideve dhe sekuenca e 22 mbetjeve aminoacide në N. - u përcaktuan terminali.Li Yuesheng etj.(1985) izoloi dhe pastroi një tjetër PLA2 nga helmi i Viper rotundus në Fujian.Nën-njësia e PLA2 * është 13 800, pika izoelektrike është 10,4 dhe aktiviteti specifik është 35/xnioI/miri mg. Me lecithin si substrat, pH optimale e enzimës është 8,0 dhe temperatura optimale është 65 ° C. LD5 injektuar në mënyrë intravenoze në minj.Është 0,5 ± 0,12 mg/kg.Kjo enzimë ka efekte të dukshme antikoagulante dhe hemolitike.Molekula toksike PLA2 përbëhet nga 123 mbetje të 18 llojeve të aminoacideve.Molekula është e pasur me cisteinë (14), acid aspartik (14) dhe glicinë (12), por përmban vetëm një metioninë, dhe N-terminali i saj është mbetje serine.Krahasuar me PLA2 të izoluar nga Tuguang, pesha molekulare dhe numri i mbetjeve të aminoacideve të dy izoenzimave janë shumë të ngjashme, dhe përbërja e aminoacideve është gjithashtu shumë e ngjashme, por numri i mbetjeve të acidit aspartik dhe prolinës është disi i ndryshëm.Helmi i gjarprit nga kobra e mbretit Guangxi përmban PLA2 të pasur.Shu Yuyan etj.(1989) izoloi një PLA2 nga helmi, i cili ka një aktivitet specifik 3.6 herë më të lartë se helmi origjinal, një peshë molekulare prej 13000, një përbërje prej 122 mbetjesh aminoacide, një pikë izoelektrike prej 8.9 dhe stabilitet të mirë termik.Nga vëzhgimi i mikroskopit elektronik të efektit të PLA2 bazë në qelizat e kuqe të gjakut, mund të shihet se ka efekt të dukshëm në membranën e qelizave të kuqe të gjakut të njeriut, por nuk ka efekt të dukshëm në qelizat e kuqe të gjakut të dhisë.Ky PLA2 ka një efekt të dukshëm vonues në shpejtësinë elektroforetike të rruazave të kuqe të gjakut tek njerëzit, dhitë, lepujt dhe derrat gini.Chen et al.Kjo enzimë mund të pengojë grumbullimin e trombociteve të shkaktuar nga ADP, kolagjeni dhe acidi arachidonic natriumi.Kur përqendrimi i PLA2 është 10/xg/ml~lOOjug/ml, grumbullimi i trombociteve frenohet plotësisht.Nëse trombocitet e lara do të përdoreshin si materiale, PLA2 nuk mund të pengonte grumbullimin në përqendrimin prej 20 Mg/ml.Aspirina është një frenues i ciklooksigjenazës, e cila mund të pengojë efektin e PLA2 në trombocitet.PLA2 mund të pengojë grumbullimin e trombociteve duke hidrolizuar acidin arachidonic për të sintetizuar tromboksan A2.Konformimi i tretësirës i PLA2 i prodhuar nga helmi Agkistrodon halys Pallas në Provincën Zhejiang u studiua me anë të dikroizmit rrethor, fluoreshencës dhe përthithjes UV.Rezultatet eksperimentale treguan se konformacioni i zinxhirit kryesor të kësaj enzime ishte i ngjashëm me atë të të njëjtit lloj enzime nga speciet dhe gjinitë e tjera, konformacioni i skeletit kishte rezistencë të mirë ndaj nxehtësisë dhe ndryshimi strukturor në mjedisin acid ishte i kthyeshëm.Kombinimi i aktivizuesit Ca2+ dhe enzimës nuk ndikon në mjedisin e mbetjeve të triptofanit, ndërsa inhibitori Zn2+ bën të kundërtën.Mënyra në të cilën vlera e pH e tretësirës ndikon në aktivitetin e enzimës është e ndryshme nga reagentët e mësipërm.
Në procesin e pastrimit PLA2 të helmit të gjarprit, një fenomen i dukshëm është që një helm gjarpëri përmban dy ose më shumë maja elucioni PLA2.Ky fenomen mund të shpjegohet si më poshtë: ① për shkak të ekzistencës së izozimave;② Një lloj PLA2 polimerizohet në një shumëllojshmëri përzierjesh PLA2 me pesha të ndryshme molekulare, shumica e të cilave janë në intervalin 9 000-40 000;③ Kombinimi i PLA2 dhe përbërësve të tjerë të helmit të gjarprit komplikon PLA2;④ Për shkak se lidhja amide në PLA2 hidrolizohet, ngarkesa ndryshon.① Dhe ② janë të zakonshme, me vetëm disa përjashtime, të tilla si PLA2 në helmin e gjarprit CrWa/w
Ekzistojnë dy situata: ① dhe ②.Gjendja e tretë është gjetur në PLA2 në helmin e gjarpërinjve të mëposhtëm: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, nepërkë palestineze, nepërkë rëre dhe gjarpër me zile të tmerrshme km.
Rezultati i rastit ④ bën që shpejtësia e migrimit të PLA2 të ndryshojë gjatë elektroforezës, por përbërja e aminoacideve nuk ndryshon.Peptidet mund të thyhen nga hidroliza, por në përgjithësi ato janë ende të lidhura së bashku nga lidhjet disulfide.Helmi i gjarprit me zile në gropën lindore përmban dy forma të PLA2, të quajtura përkatësisht tipi a dhe tipi p PLA2.Dallimi midis këtyre dy llojeve të PLA2 është vetëm një aminoacid, domethënë, glutamina në një molekulë PLA2 zëvendësohet nga acidi glutamik në molekulën tjetër PLA2.Megjithëse arsyeja e saktë për këtë ndryshim nuk është e qartë, përgjithësisht besohet se ajo lidhet me deaminimin e PLA2.Nëse PLA2 në helmin e nepërkës palestineze mbahet i ngrohtë me helmin e papërpunuar, grupet fundore në molekulat e tij enzimë do të bëhen më shumë se më parë.Nga C PLA2 e izoluar nga helmi i gjarprit ka dy N-terminalë të ndryshëm dhe pesha e tij molekulare është 30000. Ky fenomen mund të shkaktohet nga dimeri asimetrik i PLA2, i cili është i ngjashëm me dimerin simetrik të formuar nga PLA2 në helmin e gjarpërit me zile lindore. dhe gjarpër me zile diamanti perëndimor.Kobra aziatike përbëhet nga shumë nënspecie, disa prej të cilave nuk janë shumë të përcaktuara në klasifikim.Për shembull, ajo që dikur quhej nëngrupi Cobra Outer Caspian tani njihet
Ajo duhet t'i atribuohet Kobrës së Jashtme të Detit Kaspik.Meqenëse ka shumë nënspecie dhe ato janë të përziera së bashku, përbërja e helmit të gjarprit ndryshon shumë për shkak të burimeve të ndryshme, dhe përmbajtja e izozimave PLA2 është gjithashtu e lartë.Për shembull, helmi i kobrës
Të paktën 9 lloje izozimash PLA2 të specieve r ^ ll u gjetën në, dhe 7 lloje izozimash PLA2 u gjetën në helmin e nëngrupit të kobrës Caspian.Durkin et al.(1981) studioi përmbajtjen e PLA2 dhe numrin e izozimave në helme të ndryshme gjarpërinjsh, duke përfshirë 18 helme kobra, 3 helme mamba, 5 helme nepërkash, 16 helm gjarpërinjsh me zile dhe 3 helme gjarpërinjsh deti.Në përgjithësi, aktiviteti PLA2 i helmit të kobrës është i lartë, me shumë izozima.Aktiviteti PLA2 dhe izozimat e helmit të nepërkës janë mesatare.Aktiviteti PLA2 i helmit të mamba-s dhe helmit të gjarprit me zile është shumë i ulët ose nuk ka aktivitet PLA2.Aktiviteti PLA2 i helmit të gjarpërinjve të detit është gjithashtu i ulët.
Vitet e fundit, nuk është raportuar që PLA2 në helmin e gjarprit të ekzistojë në formën e dimerit aktiv, siç është gjarpri me zile rombofora lindore (helmi i gjarprit C. përmban tipin a dhe tipin P PLA2, të cilat të dyja përbëhen nga dy nënnjësi identike , dhe vetëm dimeraza ka
Aktiviteti.Shen et al.propozoi gjithashtu që vetëm dimeri i PLA2 i helmit të gjarprit është forma aktive e enzimës.Studimi i strukturës hapësinore vërteton gjithashtu se PLA2 e gjarpërinjtë me zile perëndimore ekziston në formën e dimerit.Përbërja e peshkut
Ekzistojnë dy PLA ^ Ei dhe E2 të ndryshme të helmit të gjarprit, në të cilat 仏 ekziston në formën e dimerit, dimeri është aktiv dhe monomeri i tij i disociuar është joaktiv.Lu Yinghua etj.(1980) studioi më tej vetitë fizike dhe kimike dhe kinetikën e reaksionit të E. Jayanthi et al.(1989) izoloi një PLA2 bazë (VRVPL-V) nga helmi i nepërkës.Pesha molekulare e monomerit PLA2 është 10000, e cila ka efekte vdekjeprurëse, antikoagulante dhe edema.Enzima mund të polimerizojë polimere me pesha të ndryshme molekulare në kushtet e PH 4.8, dhe shkalla e polimerizimit dhe pesha molekulare e polimereve rriten me rritjen e temperaturës.Pesha molekulare e polimerit të gjeneruar në 96 ° C është 53 100, dhe aktiviteti PLA2 i këtij polimeri rritet me dy
Koha e postimit: Nëntor-18-2022